2021年，經濟合作與發展組織（OECD）正式發布了一項具有（yǒu）裏程碑（bēi）意義的測試指南——第497號（TG 497），首次將一套（tào）完整的綜合體（tǐ）外測試方案納入國際（jì）毒（dú）理學評價體係，該（gāi）方案用於化學品的皮膚致敏性評估，被視為可完全替代動物實驗。緊接著（zhe），OECD於2022年（nián）又發布了另（lìng）一（yī）項綜合體外測試（shì）方案（àn）TG 467，用於評估眼部腐蝕與刺激。盡管目前僅有這兩項指（zhǐ）南作為完全替代相應動物實驗的方案（àn）被納入（rù）官方毒理測試評價體係，但它們的推出仍標誌著在（zài）部分領域，非動物方法已由“輔助性工具”躍升為決策（cè）層麵的主導手段，實現了特定毒理終點的完全替代。但正如TG 497的成功案例（lì）所揭示的那（nà）樣，實現“完全（quán）替代”的（de）道路並非坦（tǎn）途——每一個被采納（nà）的替代方案都需要在對生物機製深入理解的基礎（chǔ）上，實現方法的（de）標準化、完成多中心驗證及確保替（tì）代方案與人體真實（shí）反應（yīng）的高度一致性。因此，目前（qián）替代（dài）成（chéng）功更多是個（gè）別突破而非普遍現（xiàn）象。在了解TG 497前，先簡要了解下皮膚致敏的過程和（hé）機理：化合物引發（fā）皮膚致敏（mǐn）反應主要涉及三個連續的生物學過程。

首先，多數低分子質量（通常小（xiǎo）於500道爾頓）的化學（xué）物質本身不能（néng）被免疫（yì）係統直接識別，因此它們需首先與皮膚中的蛋白質發生共價結合，形成所謂的半抗（kàng）原複合物。這種修飾後的蛋白質結構被免（miǎn）疫係統識別為“外來”，成為真正具有免疫原性的（de）抗原，進而觸發遲發型（IV型）變態反應，即皮膚致（zhì）敏反應的起點；

第二步是角質形（xíng）成細胞的應（yīng）激激活。在接觸化學物質後，表皮中的角（jiǎo）質形成（chéng）細胞會被刺激而（ér）激活，釋放一係列促炎因子，如各（gè）種白細胞介素和胸腺基質淋巴細胞生成素等（děng）。這些細胞因子的釋放不僅增強局部炎症反應，還具有重要的免疫信號（hào）功能，可吸引並激活樹突（tū）狀細胞及朗格漢斯細胞向接（jiē）觸部位遷移；

第三步是樹突狀細胞的激活與抗原提呈。這些抗原遞呈細胞在接觸刺激部位攝取半抗原複合物後，成熟並遷移至區（qū）域性淋巴結，在那裏與T細胞相互作用，完成抗原提呈，最終形成免疫記憶。該免疫記憶（yì）使得個體在後續暴露（lù）相同化學物質時（shí）迅速出現過敏反應，表現（xiàn）為（wéi）典型的過（guò）敏性（xìng）接觸性皮炎。

從皮膚首次接觸某種化學（xué）物質，到反複暴露後誘發（fā）過敏（mǐn）性接觸性皮炎的全過程（chéng），在（zài）現代毒理（lǐ）學中被統稱為“有害結局通（tōng）路”。該通路由（yóu）多（duō）個生物學過程（chéng）構成，其中的關鍵環節被稱為“關鍵事（shì）件”。由上文可知，皮（pí）膚致敏（mǐn）的有（yǒu）害結局通路包含（hán）三個關鍵事件（jiàn），即（1）半抗原形成；（2）角質（zhì）形成細胞的（de）激活（huó）和（3）樹突狀細胞激活。在所有已知的“有害結局（jú）通路”中，皮膚（fū）致敏性“有害結局通路（lù）”是建立最早、機製最明確，且相對（duì）容易進行體外模擬的免疫反應，因（yīn）此成為（wéi）了替代方法開發的突破口。

在傳統毒理學評（píng）估中，皮膚致敏性通常依（yī）賴動物整體反應模型進行（háng）判斷，代表性方法包括：（1）豚鼠皮膚致（zhì）敏試驗（yàn），用於綜合評估致敏（mǐn）起始階段與激發階段的反應；（2）局部淋巴結試（shì）驗，聚（jù）焦於皮膚致敏階段。以局部淋巴結試驗為例，一（yī）次（cì）標（biāo）準實（shí）驗需消耗（hào）至少20隻小鼠。據統計，截至2018年，僅（jǐn）在歐盟REACH製度實施框架下就已有超過33,000隻小鼠被（bèi）用（yòng）於皮膚致敏性（xìng）測（cè）試。

那（nà）麽TG 497中所列的動物替代（dài）技術是如何（hé）實現的呢？TG 497 所采用（yòng）的（de）“三選二（èr）策略”是基於皮膚致敏（mǐn）性有害結局通路中的前三個關鍵事件所構建的一種綜合性評估方法，旨在（zài）判定受試化學物是否具有（yǒu）皮（pí）膚致敏潛力。

首先，直（zhí）接肽反（fǎn）應實驗（DPRA，OECD TG 442C）用於評估第一關鍵事件，即被測物（wù）是否具有與蛋白質共價結合形成半（bàn）抗（kàng）原的能力。該方法（fǎ）采用合成的含半胱氨酸或賴氨酸（suān）殘基的肽段作為模型受體，與被測物共同孵育後（hòu），通過測量肽的消耗率評估（gū）其反應性。反應結束後（hòu），利用高效液相色譜對肽（tài）段（duàn）殘留量進行定量分析。若肽的消耗（hào）顯著，說明化學物能與肽發生共（gòng）價反應，具備潛在致敏性，從而完成對半抗原形成關鍵事件的評價。

其（qí）次，角質形成細胞（bāo）激活試（shì）驗（yàn）（KeratinoSens™, OECD TG 442D）用（yòng）於評估第二（èr）關鍵（jiàn）事件——角質（zhì）形成細胞的氧化應激與促炎反應激活，該事件在有害（hài）結局通路中處於信號（hào）放大的早期階段。KeratinoSens™方法基於轉基因人永生化角質形成細胞係HaCaT，該細胞穩定表達一個由抗氧化反應元件驅動（dòng）的熒光素酶報告基因。當潛在致敏物質刺（cì）激角質形成細胞時（shí），會引發細胞內應激響應，從而啟動熒光（guāng）素酶表達。通過測定熒光素酶活性，即可定量評（píng）估化學物對該通路的激活能力，進而判斷其是否誘（yòu）導角質形成細胞釋放促炎因子。

最（zuì）後，人源樹突狀細胞活化實驗（h-CLAT，OECD TG 442E）模擬有害結局通路中的第三關鍵事件——樹突狀細胞的激活。在（zài）致敏過程中（zhōng），被測物通過局部炎症信（xìn）號激（jī）活樹突狀細（xì）胞，後者在抗原識別（bié）、處理及向T細胞提呈抗原的過程中起到橋梁作（zuò）用。h-CLAT方法使用人急性單核細胞白血病細胞係THP-1作為樹突狀細胞的替代模型。當致敏化學物作用（yòng）於THP-1細（xì）胞後，若具免疫激活能力，將（jiāng）誘導其表麵共（gòng）刺（cì）激（jī）分子（zǐ）（如CD86和CD54）表（biǎo）達（dá）上調。通過流式細胞（bāo）分析檢測這些表麵標誌物的相對熒光強度變化，即可判斷化學物是否具備激活（huó）免疫係統的（de）潛能。

TG 497通過整合（hé）上述三種機製互補的體外方法，從生物學不同層（céng）麵綜合（hé）評估皮膚致敏性。隻要任意兩項測試結果一致，即可做出科學、可靠的（de）致敏性判斷，從而實現在此毒理終點上對動物實驗的完全替代。這三項方法各自針對皮膚致敏有害結局（jú）通路中的（de）不同關鍵節點，組合使用時增（zēng）強了判斷的穩健性和預測一致性。

TG 497被正式寫入OECD指南前，其開發團隊以及歐盟（méng）替代方法驗證中心、美國替（tì）代方法（fǎ）驗證協調委員會和日本替（tì）代方（fāng）法驗證中心都對其評估能力進行了驗證，並與傳統動物實驗（yàn）方法如局部淋巴結試驗做了（le）對比，結果顯示TG 497在多個核心指（zhǐ）標上全麵優於局部淋巴結試驗。具體表（biǎo）現（xiàn）為：在敏感性上，TG 497達到了87%，相比之下局部淋（lín）巴結試驗為（wéi）72%，證明前者在（zài）識別真正致敏物方麵表現更優；在特（tè）異性方麵，TG 497為88%，也明顯高於局（jú）部淋巴結試驗的75%，證明其在排除非致敏物（wù）時誤判更少；在準確率上，TG 497為87.5%，也高於局部淋巴結試驗的（de）73%，證明（míng）其在整體預（yù）測（cè）效能上表現更（gèng）加（jiā）平衡；更為關鍵的是（shì），與人體不良反應數據的一致性上（shàng）TG 497達到了“非常（cháng）高（gāo）”，而局部（bù）淋巴結試驗僅為“中等偏高”，這表明TG 497在臨床（chuáng）相（xiàng）關性上更具優勢。

綜上所述，TG 497不僅在科學性能上更為出色，而且由於（yú）其（qí）不依賴動物實驗、與人體數（shù）據一（yī）致性更高（gāo），因此得（dé）以成為目前首個被國際監管機構OECD采納的完全替代皮膚致敏性動物試驗的標準體外測試方案。這一指南的（de）頒布（bù）也標（biāo）誌著毒理學替代方法從“輔助”邁入（rù）“決策級”應用的關鍵（jiàn）進展。

盡（jìn）管TG 497的成功被視為替代（dài）毒理（lǐ）學領域的重要裏程碑，但其背後反映出的研發（fā）過（guò）程也暴露了動物（wù）替代方法開發的諸多（duō）難點與局限。之（zhī）所以能取得突破，首先因為（wéi）皮膚致敏反應是目前有害結局通路建立最完善的毒理路徑（jìng）之一，機（jī）製簡單、事件明確（què）、模擬容易。相比之下，神經毒性、免疫毒性、內分泌幹擾等終點（diǎn）路徑複雜，機製不明確，至今尚無可實現完全替代的體外組合方法。其次，TG 497研發成功的核心（xīn）優勢還在於擁（yōng）有有大（dà）量來自（zì）因斑貼測試、臨床案例和職業暴露的人體皮膚（fū）致敏不良反應數據可用於方法驗證。而多數其它毒理領域（yù）仍嚴重依賴於動物實驗數（shù）據，缺乏可比對的人體資料，從而限製了相應（yīng）替（tì）代方案（àn）的實際驗證路徑。即便如此，TG 497成功進入OECD指南也曆經了漫長的驗證、標準化與互認過程（chéng）。三項子方法最早提出可追溯至2006年前後，但直至2015年才以單獨測試方（fāng）法形式被 OECD 采納，2021年方整合為 TG497——整個流程耗時逾10年。

此外TG 497在皮膚致敏評估中仍存在化學品適用範（fàn）圍的盲區（qū）：它僅適用（yòng）於（yú）小分子化學品，對金屬離子、複雜混合物、親水性或高反應性物質（zhì）尚不適用；同（tóng）時，也不適用於易幹擾測試係統穩定性的強刺激性或腐蝕性化合物。

可以說，TG497 的誕生（shēng）既（jì）是（shì）一道分水嶺，也是一麵鏡子：一方麵，它（tā）首次證明“綜合測試方案”完全（quán）可以獲得監管層麵的認可（kě），為 OECD 體係內其他毒理終（zhōng）點開發類似方法樹立了範式；另一（yī）方麵，它警（jǐng）示我（wǒ）們，唯有深入掌握生物機製、係統整合多源數據並實現方法標準（zhǔn）化與多中心驗證，替代策略方（fāng）能（néng）真正落地。更進一步，TG497 的成功表明，替代路徑更適用於（yú）機製清晰（xī）、易於體外模擬且人體數據相對充足的毒（dú）理終（zhōng）點。總之，替代並非簡化，不是單憑熱情就可以“一蹴而就”的（de），而是在更（gèng）高科學規範要求下，通過持續演化與（yǔ）完善才能夠得以實現；同時，其研發（fā）仍離不開動物實驗與人體反應數據的對照與支撐。因此，盡管TG497 為全麵替代動物實（shí）驗開了一個好頭，但在所有領域都實現這一目標仍（réng）有漫長的科學探索與（yǔ）製度建設之路要走。